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美国国立生物技术信息中心，三大DNA数据库之一。

NCBI测序原始数据上传

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具体操作可以参照这篇博客，这里只补充几点。

1、申请登录号顺序

建议首先申请Biosample号，再申请BioProject号，最后申请SRA号。在第二步的过程中只需要填写第一个Biosample号就可以了。也可以先申请BioProject号，Biosample号先空着，再申请Biosample号，然后在填表中”bioproject_accession”填上申请的BioProject号就可以了。

2、填表的疑问

遇到最多的问题就是sample_name通不过，按照参考中的方法在最后添加一列“replicate”，然后填上对应的replicate描述就可以了。在填写“collection_date”时也应注意要使用标准日期格式，如“2021-07-01”，不能把月份和日期前面的0省略。“geo_loc_name”这栏填写上传样品基因型的位置，国家要采用标准的国家名称，后面跟冒号和省份，也可以不加。

在填写”SRA_metadata_acc”表时，”library_ID”可以自己编一个，不能重复，”title” 填写样品描述信息，可以采用如以下格式“RNA-Seq of organism: cultivar tissue”，“design_description”可以填写实验设计时的信息，如”control，replication 1″，”Treatment，replication 1″。

3、测序原始数据上传

建议使用Aspera上传，特别是数据量比较大时。可以参考这篇文章的方法，不过需要特别注意的最好上传文件夹，里面包含了所有需要上传的测序文件，不然是上传到根目录了，不能显示，费半天劲白传了。可以参考我的这个代码。”samples_dir”为包含测序文件的文件夹，“root_link”为NCBI提供的链接，点“Aspera Command-Line upload”右边的加号就会出现，一般是邮箱加密钥。一般是上传完成后10分钟才会看到结果。

nohup ~/.aspera/connect/bin/ascp -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh -QT -l100m -k1 -d ~/data/transcriptome/samples/fleshed/samples_dir subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/root_link &

Blast+本地化及使用方法

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原来一直用blast的，但NCBI已停止了对blast的更新，而强力推荐使用blast+,这次因为要做blast的数据量比较大，所以试了一下blast+，同时也用blast做了一下，发现blast+果然要快得多，看来习惯要改变了。其实blast+和blast的原理差不多，只不过程序参数和名称有了点变化而已，现简要介绍一下其本地化的方法：
1、下载最新版的程序，根据自己的系统选择合适的版本。
2、解压后进入程序目录……ncbi-blast-2.2.31+/bin，各个程序的功能说明可以参考我的另外一篇博客。
3、各程序的参数说明可以用自带的help，例如想查blastx的参数说明可以用： ./blastx -help
4、做blast前一般要先格式化数据库，除非只是几个序列之间的比对，例如格式化一个蛋白数据库可以用下列参数：
$HOME/……/ncbi-blast-2.2.31+/bin/makeblastdb -in uniprot_sport -dbtype prot -input_type fasta -parse_seqids -hash_index
主要几个程序的使用例子：
blastp -query protein.fa -out /protein.output -db dbname -outfmt 0 -evalue 1e-3 -max_target_seqs 20
blastn -query nucl.fa -out output -db dbname -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_descriptions 10
blastx -query nucl.fa -out output -db dbname -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_descriptions 10
参数说明:
-query： 输入文件路径及文件名
-out：输出文件路径及文件名
-db：格式化了的数据库路径及数据库名
-outfmt：输出文件格式，2.2.31版共有14种格式，6是tabular格式对应BLAST的m8格式
-evalue：设置输出结果的e-value值
-max_target_seqs：找到的最大的目标的数目，也可用-num_descriptions，tabular格式输出结果的条数

linux 安装和使用NCBI剪接边界工具splign

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splign是NCBI中一个比对cDNA和genome的一个工具，通过splign可以很方便的找到cDNA各个外显子。Windows下安装非常简单，下载后就可以直接用了，但linux版本下运行需要一些相关的包，下面介绍一下splign在linux下的安装和使用（windows中splign的使用和linux一样）。
首先下载相应的版本，我的linux系统是ubuntu 64位的，下载Linux x64，解压”gunzip splign”，修改文件属性为可执行文件”chomd 777 splign”，试着运行一下”./splign”，一般会报错”splign: error while loading shared libraries: libpcre.so.0: cannot open shared object file: No such file or directory”，那是因为缺少模块 “libpcre.so.0″， 应下载安装pcre包（pcre-8.21）。 继续阅读 →

最新blast本地化

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原来做过本地blast，但那是三年前的事了，这次来新单位后要重新自己构建blast，才发现NCBI中blast已经有了很多变化，默认连接的下载页面变成了blast+，blast+中主要程序描述如下：

Program Function
blastdbcheck 检查数据库完整性
blastcmd 从blast数据库中检索序列或其它信息
blast_aliastool 创建数据库别名
blastn 核酸序列与核酸数据库比较
blastp 蛋白质序列与蛋白质数据库比较
blastx 核酸序列与蛋白持数据库比较
blast_formatter 使用指定的ID格式化网络blast结果
convert2blastmask 转换小写的masking成makeblastdb可读格式
dustmasker 过滤掉低重复序列
lagacy_blast.pl 转换一个legacy blast search程序为blast+配对并执行
makeblastdb 格式化一个FASTA文件为一个blast数据库
makembindex 为一个存在的核酸数据库建立一个megablast索引
psiblast 查找蛋白质家族，计算提供的蛋白质的遗传距离或者建立位置特异性矩阵
rpsblast 从一个蛋白质保守区域数据库中检索蛋白序列的功能区域
rpsblast 将核酸序列以六种阅读框的形式转换成蛋白序列后从蛋白保守区域数据库中检索蛋白功能区域
segmasker 过滤掉低重复序列并转换成蛋白序列
tblastn 在核酸数据库中检索蛋白序列
tblastx

核酸与核酸数据库在蛋白质水平比较
update_blastdb.pl 在NCBI中下载blast数据库

这个blast+程序虽然功能强大了，但一下子还用不习惯，而且平时用得最多的比较两个序列的程序也没有，于是想找原来的blast，阅读了大量的说明，花了我半天的时间终于找到了，地址为：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/LATEST ，下载与系统匹配的就可以了，一般如果是windows XP 系统就下载win32的，windows 7或windows 8 64位的就下载win64，而我的系统为ubuntu 64位系统就下载了blast-2.2.26-x64-linux.tar.gz，解压后在解压文件的/bin/文件夹就可以看到熟悉的blastall,formatdb,bl2seq等程序了，具体功能描述如下（原始说明）：

Program Function
bl2seq Directly comparing two FASTA sequences
blastall legacy blast containing the subfunction of blastn, blastp, blastx, tblastn, and tblastx
blastclust Clusters input FASTA sequences into related groups
blastpgp Standalone PSI-BLAST for search of distantly related protein sequences and generate position-specific matrices
copymat Copies blastpgp output for input to makemat
fastacmd Retrieves specific sequence or dumps the sequences from a formatted blast database
formatdb Convert FASTA formatted seqeucne file into BLAST database
formatrpsdb Format scoremat files into an RPSBLAST database
impala protein profile search program, mostly replaced by rpsblast
makemat Convert the copymat files into scoremat format, no loger needed by new blastpgp output
megablast Faster batch blastn program that uses greedy-algorithm. Works in contiguous or more sensitive discontiguous mode
rpsblast reverse PSI-BLAST program for searching against conserved domain database
seedtop Pattern search program

关于程序调用方法网上有很多资料，就不多在这里重复，这里只举个简单的例子，如调用bl2seq，“./bl2seq -i seq1.fa -j seq2.fa”。

NCBI中RefSeq各种accession说明(二）

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在前面介绍了一些常见序列的accession号，其实在NCBI中还有很多accession号，仅与RNA相关的就有116种，这里各举一个例子供参考。不同的编码代号代表不同的意思，如NM_开头的表示标准序列，XM_表示预测的蛋白编码序列，NR_表示非编码蛋白的mRNA序列，AF开头的表示克隆序列，BC开头的表示模板序列，大家可以细细研究。 继续阅读 →

NCBI中RefSeq各种accession说明(一）

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我们在NCBI上找序列时，特别是看Blast结果时，经常会看到各种标记的序列，不知道哪个才是想要的，特此查了相关资料，找到了一些说明。根据个人经验，如果想找标准序列的话，mRNA就采用NM_开头的，基因组用NC_或者AC_开头的,有关RNA的编号说明，可以参考下一篇文章。 继续阅读 →